背景介绍

细胞和基因疗法（Cell and Gene Therapy, CGT）是通过改变细胞原有基因的表达以达到治疗疾病的方法，也即通过对人体细胞和基因进行修复、替换和改造，直接从患者的疾病根源进行治疗，临床应用潜力巨大，有望成为未来新药发展的主流方向之一。目前CGT治疗领域以肿瘤和罕见病为主，逐渐向其他疾病领域拓展。根据Frost &Sullivan测算，全球CGT疗法的市场规模有望在2025年达到305.4亿美元，对应2020-2025年CAGR高达71.2%。

CGT疗法包括以免疫细胞治疗、干细胞治疗和其它体细胞治疗为主的细胞疗法，还包括以病毒为载体的基因替代和非病毒载体的基因编辑治疗为主的基因疗法。细胞与基因治疗技术工艺路线主要包含三个方面：质粒、病毒载体和细胞工厂，提升这三个方面的工艺开发技术、大规模生产能力，从而能够更好地进行质量控制和成本控制。然而在CGT药物从早期研发、到成功上市需要经历多个阶段，每个阶段都存在极其复杂的不确定性，需要对其中多个关键点进行严格的质量控制，从而确保最终产品的安全性和有效性。

图1.CGT药物研发及生产流程中翌圣质控产品推荐

宿主细胞残留DNA（HCD）检测

去除宿主细胞杂质是细胞基因治疗药物在内的生物制药产品生产中的关键步骤，其中宿主细胞残留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全问题成为关键质控指标。在此情况下，建立合适的检测方法监测生产工艺，控制宿主细胞残留核酸限度，以确保产品的安全性和质量已经成为监管机构和行业内关注的重点。

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《中国药典》2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂外源宿主细胞DNA残留量不能超过100pg/剂，以细菌或真菌基质（酵母、大肠杆菌等）表达的生物制品中DNA残留量不超过10ng/剂；

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《欧洲药典》（EP10.0）通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10ng/剂；

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美国食品药品监督管理局（FDA）发布的指导原则中指出生物制品宿主细胞DNA残留限度不得超过100pg/剂，对于大剂量的生物制品（如单克隆抗体），根据其残留DNA来源及给药途径，DNA残留量可放宽至10ng/剂。

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此外，《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定，外源性DNA残留检测采用DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法。目前市场上对宿主细胞残留DNA检测，主要采用荧光探针qPCR方法，qPCR法具有极高的灵敏度、序列特异性和准确性，可为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段，现也已成为各生物制品厂家首选检测方法。

翌圣生物自主研发的E.coli宿主细胞残留DNA的qPCR法检测试剂盒，可快速高效检测生物药中宿主DNA残留量。还研发了与之配套使用的宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒，以及配套的自动化核酸提取仪器。

图2. E.coli DNA (2G)标曲范围30fg/μL~300pg/μL，R2=1，扩增效率为101.74%，各浓度检测值CV<15%

宿主细胞残留DNA片段分析

除需对DNA的残留量进行控制外，DNA残留片段大小分布也是确定其相关风险因素的重要指标。有研究表明，一个功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp可能会有一定的致病性，且残留DNA片段越大，生物制品的风险等级越高。

美国FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行业指南中建议将非致瘤性连续细胞的残留DNA量限制在10 ng/剂以下，DNA大小限制在约200bp以下。

2022年5月，国家药品监督管理局药品评审中心（CDE）发布的体内基因治疗产品要学研究与评价技术指导原则（试行）中也明确指出需对DNA残留量和残留片段大小进行控制，建议尽量将DNA残留片段的大小控制在200bp以下。

目前，行业内对于残留宿主细胞DNA片段分析，主要是利用毛细管电泳的方法。研究者们开发了一种基于毛细管凝胶电泳与敏感激光诱导荧光（CGE-LIF）检测残留DNA分子大小的方法，可以检测生物制品中残留DNA的大小，实验表明，大多数宿主细胞残留DNA片段大小为50～2 000bp。除了毛细管电泳法外，实时荧光定量PCR（qPCR）法也被用于进行生物制品中生产用细胞相关的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更简单，耗时更短。

针对上述情况，翌圣生物自主研发了E.coli&HEK293残留DNA片段分析试剂盒，采用荧光探针qPCR法原理，设计了四种不同的扩增片段（几十bp、100多bp、200多bp、500多bp），用于定量检测样本中宿主细胞残留DNA片段的大小分布情况。

图3. 宿主细胞中残留DNA片段分析检测流程图

宿主细胞残留RNA（HCR）检测

据了解，各监管机构在判定DNA产品纯度时，均会将宿主细胞残留RNA（HCR）含量作为其中一项关键检测指标。

2022年5月，国家药品监督管理局药品评审中心（CDE）发布的体内基因治疗产品要学研究与评价技术指导原则（试行）中也明确指出需对生产工艺引入的工艺相关杂质，如宿主细胞RNA等纳入产品质量标准进行控制。

美国FDA中明确规定了质粒材料的质量标准：超螺旋DNA＞85%，宿主细胞蛋白＜1%，残留细菌DNA＜1%（聚合酶链式反应测定），残留细菌RNA＜1%（高效液相色谱法或凝胶法检测不到）。

欧洲药品管理局（EMA）在《基因治疗药物产品的质量、非临床和临床方面的指导原则》中，提出应考虑宿主细胞残留RNA，以确定质粒纯度。

已知，对于生物制品的起始原材料质粒DNA中的宿主菌RNA残留检测，通常采用20年版中国药典0541通则琼脂糖凝胶电泳法。此外，USP发布的《mRNA疫苗质量分析方法-指南草案》(第二版)，对于质粒DNA质量属性的测试中提到了：宿主细胞RNA检测可采用高效液相色谱或琼脂糖凝胶电泳法。

除了琼脂糖凝胶电泳和高效液相色谱法外，行业内还会采用定量逆转录PCR（RT-qPCR）和RNA荧光定量方法检测生物制品中的宿主细胞残留RNA。RT-qPCR法由于可实现对待测样本中的残留RNA专一性扩增和精确定量，而被广泛应用。

翌圣生物自主研发的E.coli残留RNA检测试剂盒可专一快速检测样本中E.coli残留RNA。

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E.coli残留RNA检测Kit产品性能

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检测范围宽：试剂盒线性范围为2fg/uL~200pg/uL；

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准确度高：稀释线性好，且样本加标回收率在80~120%之间；

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灵敏度高：定量下限(LLOQ)分别为1fg/uL；

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精密度高：批内重复性高CV＜10%，批间差异小即中间精密度CV＜15%。

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宿主细胞残留蛋白（HCP）检测

生物制品中HCP残留含量通常被认为是产品的关键质量属性(CQA)，是工艺稳健性监测的重要评价指标，也是产品的重要质控指标。各国法规都有涉及HCP的论述，要求必须对生物药品进行分析和纯化，以将宿主细胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

《中国药典》三部（2020版）规定：针对CHO细胞，HCP残留需要<0.05%（相当于小于500ppm）；针对E.coli，HCP残留需要<0.01%。

美国药典USP<1132>章节规定：用一种灵敏度较高的方法检测药品中的HCP，其含量应该低于检测限（通常小于100ppm，即1mg总蛋白中HCP含量应小于100ng，也即<0.01%）。

酶联免疫吸附法（ELISA）是目前HCP检测最常用的方法，在2020版《中国药典》通则3412/3413/3414中提到的宿主蛋白残留检测方法均为ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研发了包括CHO宿主细胞在内的多款HCP蛋白残留量检测试剂盒。试剂盒均采用双抗夹心酶联免疫检测（ELISA）的实验原理，以及生物素-链霉亲和素放大系统，能够高灵敏的检测样本中HCP残留量。试剂盒可以用于生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

图4. 翌圣HCP ELISA试剂盒产品特点

核酸酶残留检测

在治疗性药物（如抗体、病毒载体药物等）的生产及工艺流程中，核酸杂质的去除至关重要。UltraNuclease全能核酸酶，又称为广谱核酸酶、非限制性核酸内切酶，其能够在多种实验条件下切割和降解各种形式的DNA和RNA，广泛用于去除生物制品中的核酸。

在正常的纯化步骤中，全能核酸酶作为杂质很容易被去除。为检测全能核酸酶具体残留量，行业内常采用UltraNuclease作为标准品，开发与之配套的ELISA试剂盒。

翌圣自主研发的UCF.ME® UltraNuclease ELISA Kit正是采用双抗体夹心酶联免疫检测（夹心ELISA）原理，能够准确检测样本中全能核酸酶的残留量，该试剂盒在线性、重复性、回收率及特异性等方面均表现稳定。

图5. 翌圣核酸酶ELISA试剂盒实验原理（双抗夹心ELISA法）

复制型病毒（RCL/RCR/rcAAV）检测

大多数应用于细胞基因治疗的病毒载体均被设计为复制缺陷型。对于复制缺陷型病毒载体，在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组，导致产生复制型病毒，其中包括复制型慢病毒(RCL)、复制型逆转录病毒(RCR)和复制型腺相关病毒(rcAAV)。终产品中复制型病毒的存在有可能引起病人不良反应，构成临床隐患和潜在危险，甚至引发肿瘤，故对复制型病毒检测是安全性检测中非常重要的项目。

随着病毒载体在CGT领域应用越来越广泛，相关法规和技术原则对监测复制型病毒提出了建议。

2022年CDE发布《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》和《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》都提到病毒载体制备工艺中，复制型病毒是安全性风险关注点之一，应采用经验证的方法开展检测，如指示细胞培养法、直接qPCR法等。

2020年1月28日，FDA发布的《关于细胞与基因治疗申请(INDs)的化学、制造和控制(CMC)指导原则》中提到：对于生产过程中产生的RCA、RCR等，需要进行病毒收获液、病毒原液、制剂等的检测。

针对上述情况，翌圣生物自主研发了一系列复制型病毒（RCL/RCR/RCA/rcAAV）检测试剂盒，基于荧光探针定量PCR原理，采用qPCR法特异性扩增对应复制型病毒的序列，专一快速的检测各种使用病毒载体相关的细胞基因治疗产品中可能发生的复制型病毒的潜在风险。

图6.翌圣生物rcAAV-2复制型腺相关病毒检测实验流程

CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒

已知CAR-T和TCR-T细胞治疗，均是将含有CAR或TCRαβ序列的目的基因构建到慢病毒或逆转录病毒载体中，然后进行病毒感染T细胞，获得CAR-T或TCR-T细胞。这些载体基因整合在T细胞基因组中，一方面显示有T细胞进行了CAR或TCR基因修饰，一方面又是一个安全性指标，可能会因整合而带来原癌基因的激活或抑癌基因的失活等造成二次肿瘤的风险。尽管现在载体的设计已经大大降低了整合的风险，但这种风险仍未完全消除，因此需要对整合到细胞基因组中的病毒载体拷贝数进行检测。

针对CAR和TCR基因整合带来的潜在风险，国内外的药品监管相关机构都发布了相应的指导性文件。

2018年6月，中国食品药品检定研究院颁发的《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》明确规定CAR基因拷贝数≤5 copies/细胞。

目前，实时荧光定量PCR（qPCR）广泛用于基因表达、拷贝数确定和病原体检测研究等，这种方法可以准确定量样品中DNA或RNA的核酸靶序列数量。因此，CAR和TCR等转基因拷贝数的检测行业内也普遍采用qPCR的方法。

翌圣生物自主研发了CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒，采用多重荧光探针qPCR法分别检测CAR-T或TCR-T细胞基因组中CAR或TCR基因的拷贝数以及人体细胞中单拷贝基因(Single Copy Gene, SCG)。

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CAR/TCR基因拷贝数检测Kit产品性能

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符合法规：按照法规要求进行全面验证，可提供验证报告；

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保障品质：试剂盒原材料全自主研发，qPCR Mix等酶产品在超洁净酶工厂生产；

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灵敏度高：定量限可达21copies/μL，检测限1.05copies/μL；

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精密度高：批内重复性高，批间差异小；

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专属性强：特异性检测CAR或TCR基因拷贝数，不受其他外源基因组DNA干扰；

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防干扰强：添加内部对照（IC），便于排除样本干扰、反应配制异常等因素

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支原体检测

相较于传统化学药物，以基因治疗、细胞治疗或组织工程为基础的新型生物治疗业已成为前沿性治疗药物。这些药物大多以细胞为载体制备或构建，因此，在此过程中，对于细胞种子库、病毒培养和收获、临床治疗用途的细胞等生物制品中生产制备过程易受到支原体污染。

支原体是一种比较常见但通常难以去除的污染类型，对于涉及细胞培养的生物制品工艺过程，法规要求“必须确保无支原体污染”。目前国内外药典推荐的支原体检测方法主要是基于培养法、NAT(核酸扩增法)法、细胞培养指示法。

翌圣生物MycAway®支原体qPCR检测试剂盒（探针法）(2G)是基于NAT法的一种快速定性检测生产原料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治疗用细胞中潜在支原体污染的产品。该试剂盒基于定量PCR技术，使用Taqman荧光探针定性检测待测样本中支原体DNA，可覆盖183种支原体DNA序列；并且严格按照EP 2.6.7和JP G3支原体检测相关指南和要求进行验证，具备灵敏度高、特异性好、安全性好等特点。该试剂盒还能够与MolPure®磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒搭配使用，通过手动提取或者使用自动化核酸提取仪自动提取样本核酸，再由qPCR收集探针的荧光信号，从而对检测结果进行判定。

图7.翌圣生物NAT法支原体qPCR检测实验流程

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