类器官是干细胞衍生的体外3D自组织培养物，与来源组织拥有分子机制与结构功能的相似性，因此已经在发育生物学、药物发现和再生医学领域展现出巨大潜力。然而，当前类器官（尤其是神经类器官）血管化技术仍不成熟，球体直径生长到约150μm时，由于缺乏血管网络的支持，氧气、营养物质、代谢物、信号分子扩散不足，类器官中会出现缺氧和代谢物堆积，从而导致细胞增殖停滞和核心区域的坏死。在培养第60天的球状中脑类器官中便有超过50%的类器官细胞缺氧或坏死，脑类器官的功能和表型尤其受限，与人脑体内的生理机能仍有较大差距，无法精准进行疾病和药效表征。

目前，血管化技术正在不断突破。可行的路线包括加入促进血管生成的细胞因子（如VEGF）、与血管内皮细胞共培养、气液界面切片培养以及工程化技术等。不过，这些过往的技术方法仍欠缺简便性与高效性。

2025年3月17日，美国印第安纳大学及其合作团队在期刊Cell Stem Cell发表论文“Vascular network-inspired diffusible scaffolds for engineering functional midbrain organoids”，创新性地开发了一种受血管网络启发的可扩散支架（VID支架）。该支架具有生物相容性，成本低廉、坚固耐用，可批量制造，并可模拟生理扩散，从而生成几乎不出现坏死和缺氧现象的工程化的神经类器官（ENOs），显著增强了类器官的生理功能和药物筛选的准确性。

研究团队使用生物相容性塑料，通过3D打印在孔板上高通量生成了网状管腔网络。接下来，研究人员模拟原代人脑组织中的信息和物质扩散，在获得的VID支架上培养类胚体（embryonic body，使用已充分表征的中脑类器官方案，培养过程中添加了FGF-8b、BDNF、GDNF等细胞因子）以获得ENOs。

与最初的设计一致，类器官内所有细胞到最近的可扩散表面的距离均不超过150μm，可保证充足的营养和氧气供应，细胞基本处于健康状态，无缺氧坏死现象，与常规神经类器官（CNOs）存在显著差异。

图1：在VID指甲上声张的脑类器官成功发育以形成多个脑室区（VZ）结构为特征

为了进一步证明VID支架切实地利用扩散管网络直接向类器官细胞提供了营养物质、氧气和信号分子，研究人员随后对其进行了全面表征。定量染色结果再次强调，ENOs直至培养第180也未出现缺氧现象，且三种不同分子量的生长因子在灌注后均匀且高效分布于ENOs。总的来说，培养过程中ENOs内部细胞的氧气供应充足，缺氧区域显著减少，细胞活力显著提高。

图2：ENOs中介质、氧和信号分子的扩散增强

在培养第15到第180天是神经祖细胞（NPC）扩展和神经成熟的关键阶段，在ENOs和CNOs中均观察到了成熟神经元和VZ标志物的发生。但CNOs在第15天开始出现明显的坏死核心，从第15天到180天继续扩大。而ENOs缺乏坏死核心，在同一时间内非坏死增殖区也显示较少的细胞死亡。此外，但ENOs在60-180天的增殖细胞比例（ki67）高于CNOs，表现出更强劲的发育态势。

scRNA-seq测序分析显示，与传统类器官相比，ENOs中的神经前体细胞具有更低的内质网应激、缺氧和凋亡相关基因的表达，而与细胞周期、DNA复制和神经元发育相关的基因表达更高，表明ENOs的神经新生更为频繁与持续。

图3：VID支架维持了ENOs中的神经新生

需要注意的是，随着CNOs中的细胞死亡与应激的发生，细胞类型的分化也受到了严重限制。相较而言，ENOs VZ中存在更高比例的LMX1A多巴胺能祖细胞（46%对比23%）。在整体非坏死区域内，ENOs也拥有更高比例的多巴胺能神经元（37%对比25%），且这些神经元在类器官中的分布更加均匀，形成了更复杂的神经网络结构。进一步的分析显示，ENOs与原代人胚胎中脑具有更高的相似性。与CNOs相比，ENOs中未识别细胞（5%对比14%）和非多巴胺能神经元（8%对比19%）减少，多巴胺能神经元（22%对比15%）和祖细胞（35%对比28%）增加，中脑特异性标记的基因表达也有显著上调，表明ENOs中脑特异性神经发生增强。

总之，与传统类器官相比，ENOs在中脑特异性身份、氧气代谢、神经元成熟和网络活动等方面表现出更符合生理特征的功能。

图4：VID支架增强了中脑区域特异性分化

使用多电极阵列（MEA）系统记录ENOs和传统类器官的神经活动，研究人员发现ENOs在培养90天后表现出更均匀的神经活动和更复杂的神经网络连接。且ENOs的神经元放电频率、爆发频率和活跃电极数量均显著高于传统类器官，功能连接性也更强，具有定义良好的神经元网络，整体神经活动显著优于CNOs。

图5：VID支架改善了ENOs的神经活动和功能神经网络

接下来研究人员，研究了ENOs和CNOs对药物的反应，发现VID支架还解决了靠近MEA电极的神经元可能失去电活动，及药物难以到达MEA电极附近神经元造成的疗效不准的问题。

MEA结果显示，ENOs在处理后表现出明显的药理效应，包括放电事件和爆发次数减少，网络活动同步性丧失，且相关基因表达变化与药物作用机制相符。而CNOs在相同处理条件下未表现出显著的电活动变化。scRNA-seq进一步证实了处理对ENOs中神经元和星形胶质细胞基因表达的影响，表明ENOs在药物反应方面更符合生理实际情况。

图6：VID支架增强了药理学反应

本研究开发的VID支架解决了传统类器官培养中的扩散限制问题，还能支持类器官在生理灌注样条件下的长期培养和功能维持，可显著改善类器官的生理功能和药物反应表型，为药物筛选和疾病模型研究提供了更准确的平台。

作者在最后提到，未来的研究可以集中在开发更先进的生物墨水和高精度3D打印技术，以克服当前支架设计的局限性。此外，将人类脐静脉内皮细胞或其他来源的内皮细胞整合到支架中，形成更完整的可灌注血管网络，也是未来研究的一个重要方向。